儿茶素类化合物为一类主体结构为黄烷-3-醇及其没食酸酯的化合物,是茶叶中多酚物质的主要成分,约占其总量的95%以上,在幼嫩芽叶中的含量可达20%(干重)以上。儿茶素的组成和含量对绿茶品质有直接影响,与乌龙茶和红茶等半发酵和全发酵茶类为特征的品质也有直接关系。近年来的研究还揭示,儿茶素类化合物具有较强的抗氧化能力,是理想的天然抗氧化剂;而茶叶的许多保健功效也与儿茶素有密切关系。因此,儿茶素类化合物在茶树次生代谢研究中占有重要地位。
早期研究茶叶儿茶素类化合物组成种类的方法主要是薄板层析法(TLC)。近年来,高压液相色谱法(HPLC)分析已被广泛采用,甚至毛细管电泳技术也已开始应用于儿茶素的分析。本节介绍儿茶素总量的光度测定法和儿茶素组成分析的HPLC方法。
1.仪器设备
分光光度计、微量加液器、恒温水浴和HPLC等。
2.操作方法
1)儿茶素总含量的比色法
(1)试液制备:对于鲜叶样品,先用不锈钢剪刀快速剪碎,称取3g置于ml三角瓶中,加入95%乙醇25ml。置水浴上提取30min(使乙醇保持微沸状态)。过滤、冷却,用95%乙醇定容至50ml。对于成品茶样品(含水量应少于6%),先用粉碎机粉碎,过40目筛,取1g(绿茶)或2g(红茶)于ml三角瓶中,按上法进行提取。
(2)样品测定:吸取试液20~50μl于大试管中,加1ml95%乙醇,摇匀。再加1%香兰素盐酸溶液5ml,充分混合,室温下放置40min,于波长nm处测定光密度。对照标准曲线求出样品中儿茶素浓度,并计算样品中的儿茶素含量。
(3)标准曲线绘制:用L-表儿茶素配制成浓度20mg/ml的标准水溶液,然后稀释成1~10μg/ml的系列浓度,各取20μl,按上述样品测定方法进行光密度测定,制作儿茶素含量-光密度的标准曲线。
2)儿茶素组成的HPLC分析:利用配备紫外检测器或电化学检测器的HPLC系统可取得满意的分析结果,但如采用二极管阵列作检测器,则可以简化样品前处理过程和改善峰检测工作。
(1)试液制备:提取儿茶素的方法与上述相同,但改用甲醇,浓度为90%。提取液用等量正已烷在分液漏斗中萃取2次,以除去色素等杂质。如需除去咖啡碱,可用氯仿进行苯取。下层的甲醇水溶液用旋转蒸发仪除去甲醇,加蒸馏水定容至一定体积。水溶液再通过(0.45μm)微孔滤膜,滤液(5~20μl)即可注人色谱柱进行分离。
(2)色谱分析条件:10cm×0.46cm柱,固定相为1.5μm的ODSC18,流动相为2%乙酸(A)和乙腈(B),流速1.4ml/min,柱温30℃。梯度:前20min,A由93%~24%;20~23min,A为93%,采用二极管阵列检测器(DAD),波长扫描~nm,检测波长为nm。
(3)结果分析:可采用标准儿茶素混合液(总含量2mg/ml)作外标,也可用儿茶酚作内标进行定量。茶样品中各儿茶素单体的出峰顺序为:表没食子基儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯。
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